Projekt und Ziele

Für den Nachweis von Substanzen und insbesondere von Wirkstoffen stehen inzwischen hochentwickelte Analysetechniken zur Verfügung. Verschiedene Formen der Massenspektroskopie, HPLC, Gaschromatographie sowie optischen Spektroskopie ermöglichen den direkten und spezifischen Nachweis und die Charakterisierung dieser Moleküle, die bis hinunter zu pikomolaren Konzentrationen reicht und in komplexen Matrizes möglich ist.

Für die Analyse von Wechselwirkungen zwischen den Molekülen bzw. Nanopartikeln ist die Situation weniger luxuriös: Sowohl für die Messung in Lösung als auch in zellulären Systemen ist man dabei meist auf die Signale von Reportermolekülen angewiesen. Optische Reporter können Moleküle sein, deren Fluoreszenz- oder Absorptionseigenschaften sich unter der Wechselwirkung ändern. Früher wurden dazu auch radioaktive Tracer eingesetzt, deren Anwendung man heute weitestgehend zu vermeiden sucht. Elektrische Signale werden äußerst erfolgreich zur Messung von Ionentransport über Membranen hinweg genutzt, die Patch-Clamp-Technologie ermöglichte bahnbrechende Messungen vom Transport durch Ionenkanälen. Elektrochemische Tests eignen sich jedoch sensorbedingt nur eingeschränkt für die allgemeine Anwendung, weil das Signal an der Oberfläche von Elektroden erzeugt wird und nicht in der freien Lösung.

Optische Reporterassays sind daher weit verbreitet. Bei ihnen entscheiden der Umfang und die Art der Änderung der Reportereigenschaften über Sensitivität, Spezifizität und gegebenenfalls über die räumliche und zeitliche Auflösung der Analyse. Bei der Entwicklung dieser Assays ist zudem zu beachten, dass das Reportersignal von Artefakten beeinflusst werden kann. Eine Änderung des pH-Werts eines Assays kann beispielsweise die Leuchtintensität eines Fluoreszenzfarbstoffs ändern.

Lange waren optische Reportersignale auf Änderungen der Helligkeit oder der Absorption des Reporters beschränkt. Das Aufkommen der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) in den 1970er Jahren und deren Wiederbelebung kurz vor der Jahrtausendwende hat dieses die Bandbreite zugänglicher Reportereigenschaften erweitert. Im mikroskopischen Messvolumen befinden sich nur wenige Fluoreszenzmoleküle gleichzeitig. Treten beispielsweise durch Diffusion Fluoreszenzmoleküle in den Fokus ein und wieder aus, führt dies zu Helligkeitsschwankungen des Fluoreszenzsignals. Diese Fluktuationen lassen sich statistisch auswerten. Mittlerweile lassen sich nicht nur die Diffusionsgeschwindigkeit des Fluoreszenzmoleküls bestimmen, sondern auch dessen molekulare Helligkeit und Colokalisation mit einem zweiten oder gar dritten Farbstoff.

Technische Limitationen und der hohe Preis der Messtechnologie schränkten den Einsatz FCS-Technologie jedoch zunächst ein. Erst in den letzten Jahren hat sich diese Situation grundlegend geändert. Mit dem FCS-easy wurde eine versatile Hardware-Plattform entwickelt, in die weiterentwickelte Auswertealgorithmen und Assayprotokolle leicht integriert werden können. Intermittierende Laseranregung und direkter Zugriff auf den Zählerstrom der Lawinenphotodiode ermöglichen eine dramatische Verbesserung der Auswertealgorithmen. Diese Kombination ermöglicht nicht nur eine Verbesserung von bestehenden Assays, sondern vor allem neue Assays, die bisher so nicht durchführbar waren und für die eine große Nachfrage besteht.

Beispielweise gewinnt die Messung von schwachen molekularen Wechselwirkungen und ihrer Dynamik zunehmend an Bedeutung. Einige dieser Systeme gelten inzwischen als Targetsysteme für medizinische Wirkstoffe, wie etwa der zelluläre Abbau von Proteinen oder „molecular glue“, oder auch der Abbau der Wirkstoffe selbst, d.h. ihre Stabilität in physiologischer Umgebung. Die technische Herausforderung bei solchen Systemen besteht darin, kleine Signale von Bindungsereignissen vor hohem Hintergrund von freien Molekülen und eventuell Streulicht zu messen.

Partikulären Systemen gilt ebenso großes wissenschaftliches wie anwendungsnahes Interesse, weil sie zunehmend zur Formulierung von Arzneimitteln verwendet werden. Vor allem Nanopartikel, Liposomen und ähnliche vesikuläre Strukturen werden dabei verwendet. Die empfindlichen biologischen und makromolekularen Wirkstoffe können so vor ungünstigen Umgebungseinflüssen geschützt werden. Sie können zudem funktionalisiert werden, um den vorgesehenen Wirkort im Körper zielgerichtet zu erreichen.

Zetasizer, Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) und Streulichtmessungen sind etablierte Verfahren für die Charakterisierung solcher Partikel. Es fehlen aber Messverfahren, die Beladung der Partikel mit Wirkstoff oder die Verteilung oder Aggregation eines Wirkstoffs und seine Colokalisation mit weiteren Substanzen im Partikel messen können. Dazu zählt auch die „biomolekulare Corona“ der Partikel in physiologischer Umgebung, d.h. die Anlagerung oder Anreicherung von Proteinen und Lipiden um die Partikel, was von großer physiologischer Bedeutung sein kann. Die FCS-basierten Verfahren bieten nun erstmals die Möglichkeit, Assays für die Routineanwendung zu entwickeln, mit denen diese Parameter bestimmt werden können. Auch die Stabilität des Partikel-Wirkstoffverbunds lässt sich auf diese Weise messen.

Alle mRNA-basierten Medikamente und Impfstoffe, die meisten Oligonukleotide und viele Biologika und kleine Moleküle gehören zu den komplexen Arzneimitteln, deren Entwicklung, Qualitätskontrolle und Routineanalyse von den Testverfahren sehr profitieren, die in diesem Vorhaben entwickelt werden. Ein weiterhin bestehendes Problem der therapeutischen Oligonukleotide, insbesondere auch von siRNAs, für die im Rahmen des Projektes neue Analysemethoden entwickelt und etabliert werden sollen, um Qualitätskontrolle und Aufklärung von Mechanismen durchführen zu können, ist das effiziente Delivery in Zellen von Organen über die Leber hinaus. Der Markt umfasst damit alle Forschungs- und Entwicklungseinheiten in Wissenschaft, Biotechnologie und Pharmaindustrie, die auf diesen Themen arbeiten.

Im Mittelpunkt des Projekts steht die Entwicklung neuer Assaysysteme zur Charakterisierung molekularer und partikulärer Delivery-Systeme und ihrer Interaktion mit membranösen Strukturen und zur Erfassung schwacher und/oder seltener Wechselwirkungen von Wirkstoffmolekülen mit ihren Targetmolekülen. Diese neuen Assaysysteme basieren messtechnisch und analytisch auf einer Erweiterung des Methodenspektrums der bereits etablierten FCS-Technologie (FCS-easy Reader). Im Rahmen des „FCSeasy“ Projekts kam es zu unerwarteten Ergebnissen, die darauf hindeuten, dass sowohl 2D-FIDA (2-Detektoren Fluorescence Intensity Distribution Analysis) als auch die Fluoreszenzlebensdaueranalyse und insbesondere die Kombination beider Verfahren die unbedingt benötigten Erweiterungen der Meß- und Analysetechnologie für diese neuen Assaysysteme darstellen könnten. Weitere Bausteine sind messtechnische Erweiterungen zur Vermeidung von Artefakten (wie das Übersprechen des Fluoreszenzsignals in andere Kanäle) durch PIE (Pulsed Interleaved Excitation) sowie die Ausfilterung von Störsignalen durch neu entwickelte Filteralgorithmen, die die Rohdatenqualität verbessern und damit ebenfalls zur Erweiterung des Meßbereichs beitragen.

Die neuen Assaysysteme sollen in diesem Kooperationsvorhaben einerseits von der XNAPharma GmbH, der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg entwickelt werden, basierend auf den umfassenden Erfahrungen dieser Partner im Bereich der Entwicklung und Charakterisierung diverser Delivery-Systeme für Wirkstoffe. Die Vielfalt der Deliverysysteme ist dabei unabdingbar, um generell gültige und somit auch für andere Anwender relevante Testsysteme zu entwickeln.

Die Entwicklung neuer Assaysysteme im Bereich schwacher/seltener Wechselwirkungen von Wirkstoffmolekülen mit Targetmolekülen wird von der Intana Bioscience GmbH durchgeführt, die sehr erfahren ist in der FCS-basierten Anwendungsentwicklung in einem industriellen Umfeld.

Die Erweiterungen der Meßtechnik- und Analysemethoden werden einerseits von den universitären Partnern Leibniz-Institut für Photonische Technologien e.V. und Ludwig-Maximilian-Universität München parallel dazu entwickelt, zunächst unter Verwendung etablierter Assaysysteme und in einer späteren Phase dann unter Verwendung der neuen Assaysysteme, die dann auf den Forschungsgeräten der universitären Partner etabliert werden. Desweiteren wird die Swabian Instruments GmbH mit ihrer Expertise im Bereich der schnellen Signalverarbeitung eine Filterung der Rohdaten etablieren, die Störereignisse (die bei partikulären Systemen und Zell-Lysaten unvermeidlich auftreten) eliminieren und den Messbereich somit durch eine Verbesserung der Rohdatenqualität erweitern.

Die Kooperationspartner Ionovation GmbH und Kapelan Bio-Imaging mit ihrer großen Erfahrung im Bereich der Entwicklung industrieller Meßgeräte und Steuerungs- und Analysesoftware werden die notwendigen Hardware- und Software Erweiterungen für die neuen Mess- und Analysemethoden in den FCSeasy Reader transferieren. Für die spätere Integration erforderliche strukturelle Umbauten in der existierenden Hardware und Software erfolgen hier bereits parallel zur Entwicklungsphase der anderen Kooperationspartner. Der Fokus liegt der auf einer industrietauglichen Integration der akademischen Methoden und Verfahren durch die Herstellung einer hohen Benutzerfreundlichkeit. Für diese sind zentrale Themen eine geringerer Interaktionsbedarf des Benutzers mit dem Gerät durch automatische Immersionswasserzufuhr und softwareseitig eine enge Benutzerführung durch die Vielzahl der Meß- und Analysemethoden und eine abgestufte Zugriffsrechteverwaltung.